Líneas de investigación
Nuestras líneas de investigación se enmarcan dentro de la problemática general de la sequía en extensas zonas geográficas de interés agronómico del mundo (Fig. 1). En este marco, pretendemos contribuir a expandir el conocimiento de las bases moleculares de la respuesta de las plantas al estrés por falta de agua.
Figura 1. Áreas de escasez de agua en el mundo
Debido a que el agua (tanto de lluvia como por irrigación artificial) es un factor determinante en el rendimiento de los cultivos, la optimización de los recursos hídricos en general es medular dentro de uno de los más grandes desafíos de este siglo: la alimentación sustentable de 9 mil millones de personas en un mundo de clima cambiante donde la lluvia y la temperatura son cada vez más erráticas. En este contexto general, la adaptabilidad de cultivos comestibles en zonas áridas nos ha interesado y nuestro proyecto pretende contribuir a expandir el conocimiento de las bases moleculares subyacentes, explorando:
- La epigenética del estrés hídrico en plantas a través de la identificación de marcas moleculares tanto en DNA como en histonas. Prestamos particular atención a la reprogramación, es decir la reversibilidad (aparición/desaparición) de dichas marcas como consecuencia de dicho tipo de estrés abiótico.
- La ventaja más notoria de la regulación epigenética en la expresión génica es la adquisición (o pérdida según el caso) rápida de diferentes “estados transcripcionales” (generados por estímulos internos, o externos como el estrés que nos ocupa), que son heredables, pero también reversibles. La metilación en citosinas del DNA en el clásico contexto CpG es sin duda la marca epigenética mejor estudiada, pero también en la última década se ha avanzado mucho en el estudio de las modificaciones covalentes incorporadas in vivo a lisinas de histonas.
- La noción de que la herencia trans-generacional de marcas de metilación en citosinas es más frecuente en plantas que en animales, y menos sujeta a reversibilidad, es consistente con el estilo de vida sedentario de las plantas y con el hecho de que las plantas establecen su línea germinal tardíamente durante su desarrollo, permitiendo por lo tanto la transmisión a su descendencia de memorias epigenéticas acumuladas durante la vida adulta.
- La variación epigenética puede producir diferentes fenotipos y, a partir del surgimiento de nuevos “epialelos” estables en poblaciones naturales de plantas, tener importantes implicancias en la Evolución en general. Mecanísticamente, una importante diferencia con sistemas animales es que en plantas, la metilación en citosinas no está asociada necesariamente a represión transcripcional de la expresión génica a través de cambios en la estructura de la cromatina.
la función biológica de las proteínas de la familia ASR (llamada así por abscicic acid, stress y ripening), exclusivas del reino vegetal (pero ausentes en Arabidopsis) y que participan, junto a muchas otras, en la respuesta a este tipo de estrés abiótico. En los últimos años hemos contribuido al conocimiento sobre los genes Asr y proteínas ASR, cuyas características principales se resumen a continuación:
- Organización genómica, expresión y clasificación:
La familia de proteínas ASR es exclusiva del reino vegetal. A pesar de que la planta modelo Arabidopsis carece de genes Asr, la familia está ampliamente distribuida y en tomate está compuesta de cuatro genes expresados diferencialmente bajo estrés hídrico (falta o escasez de agua). Por conveniencia, las proteínas codificadas han sido recientemenre clasificadas como un nuevo grupo de LEAs (late embryogenesis abundant) dado que comparten algunas propiedades, tales como pequeño peso molecular, grado de hidrofilicidad y patrones órgano-especificos de expresión. - Historia evolutiva:
Se remonta a las gimnospermas, las primeras plantas con semilla, que aparecieron durante el período Carbonífero tardío, por lo menos hace 300 millones de años. En este escenario, propiedades de resistencia a la sequía propias de las coníferas -como el pino- deben haber sido críticas durante su evolución en el período Permiano, cuando la Tierra continental se volvió fría y seca. Hemos demostrado que la familia ASR estuvo involucrada en la adaptación (mediante selección positiva de tipo darwiniana) a climas secos. - Bioquímica:
La proteína ASR1 (la única estudiada, de la familia), de 14 kDa, tiene dos regiones altamente conservadas; la primera, corresponde a la secuencia amino-terminal y contiene 6-7 residuos de histidina que podrían constituir un sitio de unión a Zn2+; y la segunda, corresponde a los 70 aminoácidos de la región carboxi-terminal en la cual se encuentra la supuesta señal de localización nuclear (NLS). - Función:
Experimentos bioquímicos muestran que ASR1 de tomate es capaz de unirse a DNA, hecho consistente con su función propuesta por un grupo francés como factor de transcripción de genes que codifican a transportadores de azúcares. También se especula con que tienen función de chaperonas en el citoplasma. Recientemente, las proteínas ASR han sido detectadas mediante modernas estrategias de proteómica. Otros laboratorios han observado los fenotipos exhibidos por distintas especies de plantas que llevan a Asr1 como transgén.
Aportes del grupo a la temática
En el modelo tomate:
Una inspección panorámica sobre el status de metilación del genoma de tomate en general, utilizando enzimas de restricción sensibles o insensibles a metilación, nos reveló una significativa abundancia de citosinas metiladas en el contexto CNG (donde N es cualquier nucleótido). Este tipo de metilación está poco explorada en plantas. Además, usando el gen Asr1 de tomate como modelo y la metodología de bisulfito, encontramos que el estrés hídrico genera, en las hojas, la clásica metilación del tipo CG en el primer exón y pérdida de metilación CNN en 75 de los 100 sitios analizados, mayormente en el intrón (Fig. 2), concomitantemente con un aumento de niveles de mRNA. Estos resultados muestran un ejemplo de una distribución genómica novedosa: en la región codificante de un gen no repetitivo.
Figura 2. Resumen de los resultados sobre diferentes tipos de contexto de metilación en las citosinas del ADN de hojas de tomate, en situaciones basales y de estrés por falta de agua.
En cuanto a marcas epigenéticas en histonas, observamos que varias típicamente asociadas a represión transcripcional en Arabidosis, p. ej. H3K9me2, en tomate, por el contrario, existen en el contexto de activa expresión (genes constitutivos UBI y EF-1, Fig. 3).
Figura 3. Inmunoprecipitación de Cromatina (ChIP) de hojas de tomate con anti-H3 (barras negras), H3K9me2 (barras blancas) o suero no-immune (barras grises, apenas perceptibles) seguida de real-time PCR. A: Resultados normalizados relativos a INPUT. B: Mismos resultados presentados como enriquecimiento relativo a suero no-immune.
En el modelo levadura:
Con la colaboración del laboratorio de las Dras. Mariana Bermúdez-Moretti y Susana Correa-García, hemos expresadoAsr1 en células wild type de Saccharomyces cerevisiae y mutantes deficientes en dos de las kinasas claves del camino HOG: Hog1 y Pbs2. Cuando células wild type se sometieron a estrés salino, la proteína ASR1 protegió levemente, mientras que en células deficientes en Hog1, que presentan un fenotipo muy sensible al estrés osmótico, ASR1 protegió significativamente.
Además, se analizó la localización subcelular de ASR1 en células wild type y deficientes en la vía HOG, por microscopía confocal. Para nuestra sorpresa, encontramos que ASR1 se localiza principalmente en el citoplasma (Fig. 4), lo cual plantea un interesante enigma, ya que su rol postulado hasta ahora era el de factor nuclear de transcripción. Su rol en el citoplasma podría ser el de chaperona, preservando a otras proteínas en el estrés.
Figura 4: Inmunodetección de ASR1 (verde) en levaduras trasformadas (wild type y mutantes en el gen hog), mediante microscopía confocal. La tinción de núcleos se realizó utilizando Ioduro de Propidio (IP, rojo).
En el modelo tabaco:
Con la colaboración del Dr. José Estévez (miembro del grupo), se determinó la localización intracelular de ASR1 en un sistema vegetal, tabaco, obteniéndose los resultados mostrados en la Fig. 5, similares a los hallados en levaduras.
Figura 5. Hojas de Nicotiana benthamiana fueron co-infiltradas con dos cultivos de Agrobacterium tumefaciens conteniendo vectores binarios para expresar las construcciones de fusión ASR1-nEYFP y ASR1-cEYFP. Los núcleos de las hojas fueron teñidos con DAPI (azul) y observados mediante microscopía confocal, a la vez que la fluorescencia (verde) debida a la formación de dímeros de ASR1 se observó mayormente fuera del núcleo.
Publicaciones de los últimos 5 años:
Subsidios actuales:
- Subsidio plurianual otorgado por CONICET (PIP 112-200801-02812). Proyecto: “Exploración de las bases moleculares del rol de las proteínas ASR de plantas en la protección contra el estrés hídrico utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae como modelo”. Co-director: Dra. Mariana Bermúdez-Moretti. Período 2009-2011.
Monto: $ 90.000 - Subsidio trianual otorgado por UBA (UBACyT X104). Proyecto: “La familia de genes Asr en plantas: perspectivas moleculares”. Período 2008-2010.
Monto: $ 22.000/año.
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Integrantes del Grupo
INVESTIGADOR A CARGO
Dr. Norberto D. Iusem
Inv.
Independiente
CONICET
Investigaciones publicadas
en PubMed
BECARIOS
Dr. Martiniano Ricardi
Doctoral CONICET
Dr. Rodrigo Matias Gonzalez
Doctoral CONICET
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